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Nova técnica baseada no CRISPR permite editar simultaneamente duas regiões do genoma

Método permitiu identificar funções de pares de genes, algo que os geneticistas ambicionavam há tempos

 

Uma nova técnica vai permitir aos  cientistas  editarem simultaneamente vários trechos do genoma, o que permitirá entender melhor como diferentes segmentos  de DNA cooperam para proporcionar saúde ou criar  doenças.

Graças a sua capacidade de manipular com precisão o genoma, permitindo assim uma melhor compreensão da função de um gene  a partir da observação dos efeitos de sua exclusão, a ferramenta CRISPR revolucionou o estudo do genoma humano. Mas ainda havia uma demanda a ser atendida:  a capacidade de remover simultaneamente vários genes ou fragmentos de genes na mesma célula. Afinal,  esse tipo de intervenção no genoma seria fundamental para que se possa entender como diferentes partes do genoma trabalham juntas nos contextos da fisiologia normal e das doenças.

Agora, essa ferramenta existe graças às equipes de Benjamin Blencowe e Jason Moffat, ambos professores de genética molecular no Donnelly Center for Cellular and Biomolecular Research.

A técnica, denominada Cas Hybrid for Multiplexed Editing and Screening Application,  recebeu o apelido de  ‘CHyMErA’. O novo método pode ser aplicado a qualquer tipo de célula de mamífero para segmentar sistematicamente o DNA em várias posições ao mesmo tempo, conforme descrito em um estudo publicado na revista Nature Biotechnology .

Muitas vezes descrito como a “tesoura” do genoma, o CRISPR trabalha enviando uma enzima de corte de DNA para os locais desejados no genoma por meio de moléculas guias de RNA, projetadas para aderir ao local de destino. A enzima de corte de DNA mais usada é o Cas9.

Desde o surgimento do Cas9, outras enzimas do Cas com propriedades distintas foram identificadas por cientistas que buscam melhorar e expandir as aplicações da tecnologia. Diferentemente da tecnologia CRISPR-Cas9, o CHyMErA combina duas enzimas diferentes de corte de DNA, Cas9 e Cas12a, para permitir aplicações mais versáteis. Cas12a é uma enzima que pode ser usada para gerar várias moléculas de RNA guia na mesma célula, que é essencial para a edição simultânea de DNA.

Thomas Gonatopoulos-Pournatzis, um pesquisador associado do grupo de Blencowe, passou vários anos tentando desenvolver a edição combinatória de genes testando as enzimas Cas9 e Cas12a por conta própria. Ele então teve a ideia de combinar essas enzimas para gerar o sistema CHyMErA.

“Estávamos tentando várias abordagens para induzir deleções de fragmentos genéticos e nada funcionou tão bem quanto o CHyMErA”, diz ele. “Fiquei emocionado quando, juntamente com Shaghayegh Farhangmehr, um estudante de doutorado no laboratório Blencowe, vimos a primeira evidência de que o CHyMErA foi bem-sucedido na exclusão de segmentos genéticos. Obtivemos esses resultados no Boxing Day e foi o melhor presente de Natal que eu poderia desejar para.”

O próximo passo foi aproveitar o CHyMErA em estudos  de grande escala para analisar sistematicamente como os genes agem juntos, bem como as funções de certas partes  de cada gene. A equipe de Blencowe, que estuda a regulação e a função de segmentos gênicos conhecidos como exons, abordou Moffat, cujo grupo havia desenvolvido uma vasta experiência com a tecnologia CRISPR.

“Com o CHyMErA,  podemos usar a melhor das duas enzimas”, diz Michael Aregger, pesquisador associado do laboratório Moffat, que desempenhou um papel fundamental no desenvolvimento dos aplicativos baseados em tela do CHyMErA. “O Cas9 foi aprimorado pela comunidade para ter uma eficiência de edição muito alta, enquanto o Cas12a permite a multiplexação de RNAs guia e, portanto, fornece muito mais flexibilidade na localização de locais no genoma que podemos cortar”.

Em uma aplicação do CHyMErA, os pesquisadores direcionaram pares de genes conhecidos como paralogs, que têm um código de DNA semelhante, mas permanecem pouco estudados porque eram difíceis de pesquisar. Como os parálogos surgiram pela duplicação de um gene ancestral, assumiu-se que eles teriam papéis similares. Mas sua função não pôde ser revelada pelos métodos de direcionamento monogênico existentes, normalmente empregados em exames genéticos, principalmente porque o outro parálogo compensaria a falta do outro.

“Com o CHyMErA, podemos excluir os dois paralelos em pares para ver se essa função ancestral é importante para a sobrevivência da célula”, diz Kevin Brown, pesquisador sênior do laboratório Moffat e co-autor principal do estudo, juntamente com Aregger e Gonatopoulos-Pournatzis. “Agora podemos analisar uma classe de genes que antes era dada como perdida”.

Depois de desativar cerca de 700 pares de paralelos,  a análise confirmou que muitos desses pares de genes realmente desempenham papéis semelhantes na sobrevivência celular, enquanto outros têm funções distintas.

Outra característica do CHyMErA é que o Cas9 e o Cas12a podem ser implantados em locais próximos do genoma para cortar fragmentos de genes, como éxons. Isso permitiu à equipe excluir individualmente milhares de exons que estavam ligados ao câncer e à função cerebral, mas que não se podia estudar usando  apenas o Cas9. Os exons são variavelmente incluídos nas transcrições  dos genes e podem modificar a função das proteínas codificadas, embora a maneira como os exons individuais contribuam para os processos celulares permaneça pouco compreendida. Dos 2.000 éxons analisados ​​pelo CHyMErA, mais de 100 foram considerados críticos para a sobrevivência celular, permitindo que pesquisas futuras se concentrem agora em esclarecer seus possíveis papéis na doença.

“Depois de identificar os exons que têm um papel crítico na doença, podemos usar essas informações para desenvolver novas terapias”, diz Gonatopoulos-Pournatzis.